आरएनए पहचान के लिए आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया की संवेदनशीलता में सुधार कैसे करें

आनुवंशिक अध्ययन करने की प्रक्रिया में, हम अक्सर अपर्याप्त आरएनए नमूनों का सामना करते हैं, उदाहरण के लिए, छोटे शारीरिक मौखिक ट्यूमर, यहां तक ​​कि एकल-कोशिका के नमूने, और विशिष्ट जीन म्यूटेशन के नमूने जो मानव कोशिकाओं में बहुत कम स्तर पर लिखित हैं।बेशक, COVID-19 परीक्षण के लिए, यदि नमूने के दौरान स्वैब सही जगह पर नहीं हैं या पर्याप्त समय नहीं है, तो नमूना का आकार बहुत कम होगा, यही वजह है कि स्वास्थ्य और परिवार नियोजन आयोग दो दिन पहले सामने आया और परीक्षण पास कर लिया है, और यदि न्यूक्लिक एसिड सैम्पलर ने छह नमूने नहीं लिए हैं, तो आप इसकी रिपोर्ट कर सकते हैं।

अभिकर्मक की संवेदनशीलता महत्वपूर्ण है क्योंकि हमें यह समस्या है या वह समस्या है, इसलिए हम आरटी-पीसीआर की संवेदनशीलता में सुधार के लिए क्या कर सकते हैं?

इससे पहले कि हम संभावित समाधानों पर चर्चा करें, उस स्थिति के साथ दो बड़ी जटिलताओं का उल्लेख करें जिसका हमने अभी उल्लेख किया है।

सबसे पहले, हम आरएनए हानि के बारे में चिंता करते हैं जब हमारे नमूने में केवल कुछ कोशिका आबादी होती है।यदि पारंपरिक पृथक्करण और सफाई विधियों का उपयोग किया जाता है, जैसे स्तंभ विधि या न्यूक्लिक एसिड वर्षा विधि, तो इस बात की बहुत अधिक संभावना है कि कुछ नमूने खो जाएंगे।एक समाधान एक वाहक अणु, जैसे कि tRNA को जोड़ना है, लेकिन फिर भी, इस बात की कोई गारंटी नहीं है कि हमारा पुनर्प्राप्ति प्रयोग ठीक है।

तो बेहतर तरीका क्या है?सुसंस्कृत कोशिकाओं या माइक्रोएनाटोमिकल नमूनों के लिए एक अच्छा विकल्प प्रत्यक्ष लिसिस का उपयोग करना है।

5 मिनट के लिए कोशिकाओं को विभाजित करने का विचार है, आरएनए को समाधान में छोड़ दें, फिर प्रतिक्रिया को 2 मिनट के लिए रोकें, फिर लाइसेट को सीधे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया में जोड़ें ताकि कोई आरएनए खो न जाए, और अंत में परिणामी सीडीएनए को सीधे डाल दें वास्तविक समय की प्रतिक्रिया में।

लेकिन क्या होगा, अगर एक सीमित प्रारंभिक बिंदु या लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति की एक छोटी राशि के कारण, हम सभी आरएनए को रीसायकल कर सकते हैं और फिर भी एक अच्छा रीयल-टाइम सिग्नल प्राप्त करने के लिए पर्याप्त टेम्पलेट प्रदान नहीं कर सकते हैं?

इस मामले में, पूर्व-प्रवर्धन कदम बहुत उपयोगी हो सकता है।

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बाद संवेदनशीलता बढ़ाने की योजना निम्नलिखित है।शुरू करने से पहले, हमें डाउनस्ट्रीम से पूछने की ज़रूरत है कि हम किस लक्ष्य में रूचि रखते हैं, ताकि पूर्व-प्रवर्धन के लिए इन लक्ष्यों के लिए विशिष्ट प्राइमरों को डिजाइन किया जा सके।

यह 100 जोड़ी प्राइमरों के साथ मिश्रित प्राइमर और 10 से 14 बार प्रतिक्रिया चक्र बनाकर प्राप्त किया जा सकता है।इसलिए, इस आवश्यकता के लिए विशेष रूप से डिजाइन किए गए मास्टर मिक्स को प्राप्त सीडीएनए को पूर्व-प्रवर्धित करने की आवश्यकता है।

10 और 14 के बीच चक्रों की संख्या निर्धारित करने का कारण यह है कि चक्रों की यह सीमित संख्या विभिन्न लक्ष्यों के बीच यादृच्छिकता सुनिश्चित करती है, जो उन शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण है जिन्हें मात्रात्मक आणविक जानकारी की आवश्यकता होती है।

पूर्व-प्रवर्धन के बाद, हम बड़ी मात्रा में सीडीएनए प्राप्त कर सकते हैं, ताकि बैक-एंड पर पता लगाने की संवेदनशीलता में बहुत सुधार हो, और हम नमूने को पतला भी कर सकते हैं और संभावित यादृच्छिक त्रुटियों को खत्म करने के लिए कई रीयल-टाइम पीसीआर प्रतिक्रियाएं कर सकते हैं।